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檢測2019-nCoV?我有‘辣酶’!

2020/3/23 14:29:35??????点击:

即將迎來2020年的春節,然而,一個冰冷的代號決意要在這節日期間印下越來越深的烙印。2019-nCoV,或者稱“2019新型冠狀病毒”正在引起一場來勢洶洶的肺炎疫情。


根據官方公布的信息,2019-nCoV屬于冠狀病毒中的一種,其遺傳物質爲正鏈ssRNA,基因組大小爲30kb。該類病毒部分感染人,部分感染哺乳動物及鳥類。極少數情況下(如SARS、MERS)會從動物傳染到人群中,並且流通狀況複雜難以預測。截至目前,這種新型肺炎已被納入乙類傳染病、采取甲類管理措施。20日,國家衛健委發布動態,下發新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒,要求各地加強檢測,全力救治患者,及時發布確診病例及疫情防控信息。


早期診斷是阻斷病毒傳播的關鍵。


根據世衛組織(WHO)公布的第一版《針對疑似新型冠狀病毒感染造成嚴重急性呼吸道感染的臨床處置指南》,RT-PCR是對臨床樣本進行診斷的首選方式。同時建議對所有可疑病例進行詳細的微生物學研究,因爲不排除與其他呼吸道病毒出現雙重感染的可能性。目前,病毒的相關基因組信息已經在genebank(MN908947)公開,同時WHO也發布了2019-nCoV的熒光定量PCR檢測指南供研究人員參考,無疑爲當前診斷體系的建立奠定了堅實基礎。


TOYOBO致力于爲各試劑盒廠家提供高性能,高性價比的診斷試劑原料,協助客戶開發有競爭力的診斷産品。


One-Step qRT-PCR探针法检测试剂盒

本试剂盒是使用了高效率逆转录酶ReverTra Ace和PCR酶Tth DNA Polymerase的两酶体系一步法荧光定量PCR试剂盒。通过将两种酶与最优化的buffer相组合,可以对微量RNA进行迅速定量。适用于对RNA病毒及低表达量mRNA的定量。同时,不易受目的基因序列的影响,可高灵敏度地检测出各种RNA。

貨號:QRZ-101


                  特征

  • 卓越的檢測效率和靈敏度

  • 特別適合多重(Multiplex)檢測體系

  • 完全兼容快速反應條件

  • 適用于高GC、難擴增的模板

  • 適用于粗提樣本檢測

  • 含有dUTP,可進行UNG防汙染


實驗例



*1 纵轴RNA拷贝数为该病毒模板下能检测的最低限,只有QRZ-101能在30 copy以下的模板量下得到一致的阳性结果

*2 模板为human total RNA按10倍梯度稀释,检测β-actin基因的表达量

*3 使用3种荧光染料标记的TaqMan探针,分别进行单重及三通道同时检测,各基因检测结果依次绘制标准曲线,在同一坐标系进行比较

無論是各種病毒的最低檢測限還是檢測的熒光終值,QRZ-101都優于同類一步法試劑,並且在多重體系下具有和單重體系相同的檢測效果。



高效率逆转录酶ReverTra Ace

本産品是基于M-MLV改良的RNA逆轉錄酶,與野生型相比活性高出4倍。通過引入突變降低了酶本身的RNaseH活性,並且提高了高溫反應性,從而高效率進行cDNA合成。

貨號:TRT-101


         特征

  • 去掉了RNaseH活性,延伸性能卓越

  • 優良的高溫反應性

  • 特別適用于RT-PCR


實驗例


以檢測Flu病毒爲例,模板拷貝數從101~106數量級,THUNDERBIRD?Probe One-step qRT-PCR Kit按标准体系进行,T公司的逆转录酶从1U增加到 4U,定量效果依然到不到本试剂盒效果。



热启动TTx DNA聚合酶(具逆轉錄活性)

TTx DNA Polymerase是基于Tth酶改造的DNA聚合酶,相比 TaqDNA polymerase,对 GC-rich 目的片段及粗样品的扩增效率更出色,具有延伸速度快、抵抗PCR抑制剂能力强,且在Mn2+存在時具有逆轉錄活性等特點。本産品添加了熱啓動抗體,實現了高特異性的PCR/RT-PCR,同時可兼容快速定量儀器。

特征

  • 相比Taq酶PCR靈敏度高,抗抑制能力強

  • 不易受抑制物影響,可進行血液直擴

  • 快速反應條件

  • 有可用于凍幹(無甘油)的版本


實驗例



左圖,使用TaqMan探針法檢測不同濃度流感病毒樣本。首先抽提RNA进行梯度稀释(1x10^2 ~ 1x10^8),以相同条件检测比较同类试剂盒检测灵敏度。QRT爲使用TTh酶的一步法定量試劑,可見HSTTX酶在處理實際樣本時效果最好。

右图,使用快速条件检测不同拷贝数(2500, 625, 156, 40, 10)的肠病毒样本。即使在10 copy的模板浓度下依然能获得真阳性结果。



重組型RNA酶抑制劑

该RNA酶抑制剂产品来源于重组型人胎盘蛋白,通过非共价结合以1:1的比率使Rnases失活,特异地抑制RNase A, B, C以及人胎盘Rnase,不可抑制的核酸酶包括Rnase T1, S1 nuclease, Aspergillus来源的Rnase以及Rnase H。

特征

  • 親和特異性與天然的Rnase抑制劑相同

  • 純度高且不含核酸酶

  • 可在较广的pH范围内具有活性(pH 5-8)

實驗例



通过qPCR比较不同公司RNA酶抑制剂的效果,从结果可知,使用TOYOBO RNA酶抑制剂时可得到更低的Ct值,效果与R公司相当。



UNG酶

本品为热敏型(Heat-labile) UNG酶(Uracil-DNA Glycosylase),可以与dUTP联合使用(QRZ-101中含有)去除qPCR检测中从前序反应带来的的carry-over污染,避免因污染导致的假阳性。该酶在55℃即可完全失活,不会影响后续PCR反应。

特征

  • 熱敏性,完美配合一步法試劑使用

  • 有可用于凍幹(無甘油)的版本


實驗例


左图,对比其他公司宣称的热敏性产品,50℃ 10分钟处理后,将各UNG酶与含有U的PCR产物混合后37度进行温育。只有TOYOBO的UNG在50度10分鍾處理後失去活性,沒有分解掉含有U的PCR産物。

右圖,比較了檢測腸病毒RNA時Ct值。使用TOYOBO的UNG條件時檢測靈敏度沒有問題,使用其他公司的産品時Ct值出現了延遲。



  高性能熱啓動抗體

(適用于Taq、TTh、TTx等酶)

anti-Taq high是针对Taq DNA聚合酶的单克隆中和抗体,使用抗体热启动法可以有效抑制非特异性扩增,增强PCR的特异性和灵敏度。在进入PCR循环前的预变性阶段,Taq酶的活性即被完全激活,使用起来方便快速。此外,可提供用于冻干的无甘油版本。

特征

  • 可兼容Taq、Tth以及TTx酶,封閉效果好

  • 使用簡便,PCR反應前和聚合酶混合即可實現熱啓動

  • 變性時間短,不影響酶在後續循環中的活性

  • 有可用于凍幹(無甘油)的版本


實驗例


使用anti-Taq high配制Realtime PCR Master Mix(成品货号:QPK-201)通过SYBR Green法检测β-actin基因,测试其热启动性能。結果顯示,即使在3個拷貝的低濃度,依然可以維持極佳的檢測能力。


截至目前,進入我們視野的是不斷增多的確診和疑似病例,堅守在一線的醫務工作者,各交通樞紐的檢疫人員,機構、專家和媒體人士披露的信息。此外還有背後大量的研究人員,産業上下全力以赴,在爲病原的鑒別、診斷和治療付出心血。更重要的是,我們每個人都重視起來並參與其中,積極防治,協力抗爭,正確科學地對待這次事件才能讓病毒無處藏身。